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重组L-天冬酰胺酶药代动力学研究及其抗原表位结构改造

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    L-天冬酰胺酶(L-asparaginase E.C.3.5.1.1)催化水解L-天冬酰胺酶生成L-天冬氨酸和氨,从而导致某些缺乏天冬酰胺合成酶的肿瘤细胞蛋白质合成障碍,选择性地杀死肿瘤细胞,临床上用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤.治疗用L-天冬酰胺酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)和欧文氏菌(Erwinia carotovora).重组E.coli pKA/CPU210009能够高效表达L-天冬酰胺酶,为我国工业化生产L-天冬酰胺酶开辟了新路.
   重组L-天冬酰胺酶样品经SDS-PAGE和反相HPLC检测分别为单一蛋白区带和单一峰,采用氯胺T法对重组L-天冬酰胺酶进行〓标记,经Sephadex G-25柱分离纯化,收集第一峰放射活性最高的溶液,经测定其标记率为33%.放射性浓度为18.6 GBq/L.经反相HPLC分离,γ-计数器检测,〓重组L-天冬酰胺酶的放化纯度为95%,双向免疫扩散法检测,标记物具有良好的免疫活性.标记的〓重组L-天冬酰胺酶满足药代动力学研究的要求.
   应用放射性核素示踪技术系统研究了〓重组L-天冬酰胺酶在组织器官的分布,在尿、粪、胆汁中的排泄,测定了血浆中〓重组L-天冬酰胺酶浓度,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物成像分析系统结合方法评价原药水平,由房室模型评价药物动力学参数.〓重组L-天冬酰胺酶静脉注射后24小时内,在尿、粪、胆汁中的排泄量分别占注射剂量的68.95%、4.44%和5.36%.静注后,浓度时间曲线符合二房室模型,初期和末端的〓分别为0.52-0.63小时和2.39-2.76小时,AUC与剂量成正比.首次提出了重组L-天冬酰胺酶的代谢产物的消除部位主要为泌尿系统的观点.
   应用重组L-天冬酰胺酶免疫家兔,DEAE-纤维素柱层析纯化IgG,采用二步戊二醛交联法,将辣根过氧化物酶标记抗体,建立了抗体夹心酶联免疫吸附法,测定大鼠血浆中E.coli重组L-天冬酰胺酶浓度,并进行药代动力学研究.本测定方法的线性范围为1-64mIU/ml,平均回收率为107.4%,静脉注射浓度为1250,2500,5000IU/kg重组L-天冬酰胺酶,血浆药物浓度与代谢时间的关系符合二房室模型,初期和末端的〓分别为0.50-0.57小时和2.45-3.02小时,AUC与剂量成正比.建立的抗体夹心酶联免疫吸附法测定大鼠血浆中重组L-天冬酰胺酶,在特异性、线性范围、精密度和回收率等方面,都能满足药代动力学研究要求.
   同位素示踪法为重组L-天冬酰胺酶药代动力学研究提供了分布、代谢、排泄等较为系统全面的资料,抗体夹心酶联免疫吸附方法的建立,为临床药代动力学研究提供了手段.同位素标记示踪法和抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组L-天冬酰胺酶及药代动力学研究结果表明,血浆药物浓度与代谢时间的关系符合二房室模型,AUC与剂量成正比.初期和末端的〓接近.两种方法相互验证,取得了比较一致的结果.这不仅为临床试验提供了手段和实验依据,而且是药品审评部门所必需的审查内容.
   E.coli L-天冬酰胺酶在治疗过程中,过敏反应极大地限制了其使用和疗效的发挥.本文首次对E.coli重组L-天冬酰胺酶的分子结构与免疫功能进行了研究,获得了具有自主知识产权的新型重组E.coli L-天冬酰胺酶,工程菌与出发菌株相比,蛋白表达量、酶活性没有改变,免疫原性下降了2.5倍.在重组E.coliL-天冬酰胺酶抗原表位预测的基础上,通过调用Brookhaven Protein Data BankPDB-ID:3ECA,获得关于E.coli L-天冬酰胺酶结构生物学信息,应用蛋白质工程软件Insight Ⅱ 2000对涉及重组E.coli L-天冬酰胺酶抗原表位的六条多肽片段进行分子结构比较分析,从而确定了重组E.coli L-天冬酰胺酶抗原表位的关键序列.抗原表位多肽序列192 TPARKHTS 199中存在连续的三个碱性氨基酸残基,这种在分子表面的不对称的电荷的分布,形成了与另一个大分子相互作用的位置,且Lys常与分子的结合功能有关.应用PCR技术对该多肽片段中Lys196进行Ala定点突变,巧妙地引入了限制性内切酶Alw44 Ⅰ单一酶切位点,利用DNA体外重组技术,以pKK233-2为表达载体,构建了突变质粒pKAM,经酶切和测序分析证明为阳性克隆.转化后在受体菌E.coli CPU210009,JM105中高效表达.pKAM/CPU210009和pKA/CPU210009,pKAM/JM105与pKA/JM105比较,具有相似的蛋白质表达谱和产酶活性.新型重组E.coli L-天冬酰胺酶和原酶蛋白在E.coli CPU210009以及JM105表达量分别为31.43%,31.90%;27.92%,30.04%.产酶活性分别为84.34IU/ml,77.55IU/ml,65.76IU/ml,58.37IU/ml.说明该定点突变并不影响酶的活性中心.E.colipKAM/JM105经破壁、硫酸胺、乙醇分级沉淀、DEAE-celloluseDE-52提取分离.应用抗体夹心酶联免疫吸附法检测,并与重组E.coli L-天冬酰胺酶的免疫原性比较,新型重组E.coli L-天冬酰胺酶与重组E.coli L-天冬酰胺酶多克隆抗体结合免疫原性降低了2.5倍.
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